لتحديد أشكال الأحياء الدقيقة العامة أو أجزائها المختلفة لابد
من صبغها بعد تثبيت على سطح الشريحة ويقصد بعملية الصبغ هذه تلوين الكائنات الحية
الدقيقة بصبغات خاصة لتحديد أجزائها المختلفة.





الصبغةStain:


هى مادة ملونة عضوية لها القدرة على الالتحام مع
المواد الأخرى معطية لها اللون. ويجب أن يتوافر لها شرطان أساسيان هما:


1.
توافر ما يسمى حامل اللون،
وهو الذي يعطى الصبغة لونها المميز.


2.
توافر العامل الذي يعطى
للصبغة القدرة على التأين، والذي يجعلها أكثر نشاطاً، ويجعل لها القدرة على
الالتحام بالجسم المصبوغ.





بعض أنواع الصبغات الأكثر
استخداما في مجال الدراسات الميكروبية.




يقصد بالصبغ البسيط استخدام صبغة واحدة فقط في صبغ الغشاء
البكتيري. ويجرى بأن توضع عدة قطرات من الصبغة على الغشاء البكتيري Smear المثبت لمدة عدة دقائق، ثم
يتم غسل الصبغة بماء وتجفف الشريحة. ويتم دراستها باستعمال العدسة الزيتية في المجهر
الضوئي، وتستخدم الصبغات البسيطة لدراسة وتوضيح الشكل العام لخلايا البكتيريا.


ومن أشهر الصبغات المستعملة فيها صبغة أزرق المثيلين، الصفرانين،
الجنسيان البنفسجي، الفوكسين.










يقصد
بالصبغ التفاضلي استخدام أكثر من صبغة واحدة، وذلك للتمييز بين مجموعات بكتيرية
مختلفة، أو للتمييز بين بعض أجزاء ومكونات الخلية البكتيرية نفسها، ومن أشهر
الصبغات التفاضلية ما يلي.




تعد هذه الصبغة من أهم الصبغات البكتيرية، لأنها مكنت من
تقسيم البكتيريا إلى مجموعتين كبيرتين هي موجبة جرام Gram positive (G+) وسالبة جرام Gram negative (G-)، استنادا
إلى اختلاف اللون الذي تأخذه البكتيريا في هذه الصبغة.


طريقة الصبغ:

• تضاف صبغة الكريستال
  البنفسجي Crystal
  violet إلى الغشاء البكتيري بعد تثبيته على الشريحة.
  
• بعد عدة دقائق يتم غسل هذه الصبغة بالماء
  ثم تضاف كمية من اليود Iodine
  (وهى مادة مثبتة للصبغة).
  
• بعد دقيقتين تقريبا، يتم
  سكب اليود من على الشريحة. وعند هذه المرحلة، يلاحظ أن كلتا المجموعتين
  البكتيرية السالبة والموجبة لصبغة جرام تبدوان باللون البنفسجي الداكن.
  
• غسل الشريحة بالكحول
  الإثيلي أو محلول Ethanol-
  acetone وهو مزيل للصبغة، ويلاحظ أن الغسيل بهذه المادة يؤدي إلى
  إزالة الصبغة من بعض الخلايا البكتيرية الموجودة على الشريحة دون بعضها
  الآخر.
  
• غسل الكحول من الشريحة، ثم تصبغ بصبغة
  الصفرانين (صبغة حمراء) لعدة دقائق، وتغسل بالماء وتجفف، ثم تفحص بالعدسة
  الزيتية.
  

يلاحظ أن (الصبغة البنفسجية + اليود) تتحد مع الجزء المعرض
للصبغ من خلية البكتيريا وتلونه باللون البنفسجي. فالبكتيريا التى تحتفظ بهذا
اللون البنفسجي بعد الغسيل بالكحول الإثيلي تسمى موجبة جرام Gram-positive(G+)، والبكتيريا التى تفقد اللون
البنفسجي عند غسلها بالكحول الإثيلي تسمى سالبة جرام Gram negative (G-) . ونظرا لأن البكتيريا السالبة
لصبغة جرام تصبح عديمة اللون عند غسلها بالكحول فإنه يصعب ملاحظتها بالمجهر، لذلك فإننا نلجأ لصبغها بصبغة أخرى وهي
الصفرانين التي تكسبها اللون الأحمر، يطلق
على الصبغة الثانية المستخدمة مثل الصفرانين اسم Counterstain. ونظرا لأن البكتيريا الموجبة
لجرام تحتفظ بلونها البنفسجي الداكن الأصلي، فإنها لا تتأثر بالصبغة الثانية
(الصفرانين) عند إضافتها.





ميكانيكية عمل صبغة جرام



اختلفت التفسيرات والآراء حول سبب اختلاف استجابة خلايا
البكتيريا لصبغة جرام، مع أنها أجمعت على أن سبب الاختلاف عائد أساسا إلى اختلاف
التركيب الكيميائى لجدار الخلية البكتيرية ومن هذة التفسيرات:-


1. جدار البكتيريا السالبة يحتوى على نسبة أعلى من الليبيدات Lipids والمواد الدهنية مقارنة
بالبكتيريا الموجبة، كما أن جدار البكتيريا السالبة يكون أقل سمكًا من الموجبة


2.
جدار البكتيريا الموجبة تحتوي
على طبقات سميكة من مادة Peptidoglycan مقارنة
بالبكتيريا السالبة،


3.
احتواء جدار البكتيريا
الموجبة على مادة معقدة من الماغنسيوم + الحمض النووي RNA بكميات كبيرة .








مقارنة
بعض صفات البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة جرام

موضوع مفيد جداً جزاك الله خير

الله يجزي الجميع

شكرا على المرور الرائع

راااااااااااااائع استمر

مشكور اخي حلمي على المعلومات